今天要來介紹一份美國皮膚科以及病理學的一份期刊，發表於2017.06
這份期刊的實驗是：比較植物提取物與米諾地爾在HaCaT細胞中的臨床實驗
我們先來了解何謂Interleukin (IL-1)？
Interleukin (IL-1) 毛髮生長抑制劑，也是圓禿中的一種因子，其實是一種過敏原。
此外，它是一個重要的斑禿(圓禿，俗稱：鬼剃頭）中的一種因子，被認為是自身免疫性的起源。
在分離的毛囊中，IL-1β使毛髮減少增長率約為60-80％。
這種毛髮生長抑制由cAMP2介導.IL-1α和IL-1β具有共同的作用受體。
Rückert發表過高劑量促炎細胞因子IL-1β引起在活體內角質細胞死亡。
掉髮再轉機的小白鼠上過量的IL-1α基因轉殖鼠和過量的IL-1α在表層皮上，
基因轉殖鼠和過量的IL-1α在表層皮上，報告了外根鞘並與視圖相容促炎性細胞因子可引起細胞死亡
毛囊上。在圓禿中，更嚴重的是，在顯示基因多態性的患者中遇到數量不足的IL-1阻斷劑。
有非常多發表米諾地爾作用的研究，有47個患者每天使用兩次米諾地爾5%精華液，根據研究中，
在圓禿患者使用有效，米諾地爾對刺激毛髮生長的影響不取決於賀爾蒙因子或對5α-還原酶的抑製劑作用。
在細胞培養裡，米諾地爾延長生存期並減緩生長人角質形成細胞老化，它作用於卵泡基質延長毛髮生長期階段的細胞
米諾地爾對頭髮生長的影響很明顯，這是邏輯上將它用作比較目的的參考任何其他促進頭髮生長的配方，我們開發了
一種植物提取物，並進行了一項臨床研究，以顯示其頭髮生長促進作用。
德國洋甘菊(Chamomilla recutita)是含有芹菜素作為活性成分
而歐蕁麻(Urtica urens)和異株蕁麻(Urtica dioica)的來源是山奈酚，楊梅素，亞油酸，油酸，鐵和β-谷甾醇。
問荊(Equisetum arvense)是含有芹菜素，山奈酚和β-谷甾醇與芹菜素和β-谷甾醇一起，千葉蓍含有葉酸和
幾種礦物質的有效成分。
另一方面，長角豆(Ceratonia siliqua)含有：生育酚，硫胺素，核黃素，泛酸，葉酸，鋅，銅，鐵等一些成分。
其中活性成分芹菜素，山奈酚，楊梅黃酮，亞油酸，油酸，鐵和鋅，記述刺激毛髮生長。
在這項研究中，我們比較米諾地爾和植物提取物在人體角質細胞（HaCaT）。
Materials and Methods (材料與方法)
The human keratinocyte cell line (HaCaT) was cultured in
Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM) with high
glucose supplemented with 10% heat-inactivated fetal
bovine serum (FBS), 2mM l-glutamine and 100U/ml
gentamicin. Cells were maintained at 37°C in a humidified
atmosphere at 5% CO2 in Newbrunswick incubator. All
supplements and media were purchased from Sigma Aldrich.
2.1. Cell Culture(細胞培養)
培養HaCaT細胞，
Dulbecco的改良Eagle's培養基（DMEM）含量高
葡萄糖補充10％熱滅活的胎兒
牛血清（FBS），2mM L-谷氨酰胺和100U / ml
慶大霉素。將細胞在37℃下保持濕潤
Newbrunswick培養箱中5％CO2的氣氛。
*所有補充劑和培養基購自Sigma Aldrich*
522.5 mg minoxidil was dissolved in 25 ml distilled water
- 25 ml ethanol mixture to get 5mM minoxidil solution. This
solution is used as 100% sample and other concentrations
(10%, 5%, 3%, 1% and 0.2%) of the solution were prepared
by dilution with distilled water.
2.2. Preparation of Minoxidil Solution(準備米諾地爾的精華液)
將522.5mg米諾地爾溶於25ml蒸餾水中 - 25ml乙醇混合物，得到5mM米諾地爾溶液。
這個溶液用作100％樣品和其他濃度製備（10％，5％，3％，1％和0.2％）溶液，用蒸餾水稀釋。
The plants were obtained from a commercial plant
supplier (Martin Bauer Group, Germany). Chamomilla
recutita (Chamomile flowers), Urtica urens (Small nettle
leaves), Urtica dioica (nettle leaves), Equisetum arvense
(Horsetail leaves), Achillea millefolium (Common yarrow
flowers), Ceratonia siliqua (Carob fruit) were used as the
plants for extract. Dried plants were fine-cut. Forty grams of
plant mixture was extracted with 500 mL distilled water for 3
hours at 100°C using a soxhlet extractor. The extract was
filtered through a 0.22 μm filter.
2.3. Preparation of Plant Extract(準備植物提取物精華)
洋甘菊recutita（洋甘菊花），Urtica urens（小蕁麻葉子），異株蕁麻（蕁麻葉），木賊屬植物arvense（馬尾葉），Achillea millefolium（常見的蓍草
花，Ceratonia siliqua（角豆果）
被作植物提取物。乾燥的植物被精細切割。將植物混合物用500mL蒸餾水萃取3次，使用索氏提取器在100°C下小時。提取物是
通過0.22μm過濾器過濾。
*植物獲自商業植物供應商（德國Martin Bauer集團）*
The Cell Proliferation Kit II (Roche XTT) was used for
cytotoxicity assay. This assay based on the cleavage of XTT
by metabolic active cell, resulting in an orange formazan dye.
The amount of orange formazan dye is quantitated using
microplate reader. Briefly, HaCaT cells were seeded into
96-well plates (1x104 cells/well) and were subjected to
different concentrations (100%, 10%, 5%, 3%, 1% and 0,2%)
an of minoxidil solution and botanical extract. After 72 hour
incubation period, 50 μl XTT and activator reagents were
added to the each plates according to the manufacturer’s
instructions. Then, cells were incubated at 37°C for 4 hours
in order that XTT reagent was reduced to formazan
compound. The absorbance was read in BIO-RAD
microplate reader (Japan) at 450 nm subtracting the
background measurement of 620 nm.
2.4. XTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay(XTT細胞增殖和細胞毒性測定)
使用Cell Proliferation Kit II（Roche XTT）細胞毒性試驗。
該測定基於XTT的切割通過代謝活性細胞，產生橙色甲dye染料。
橙色甲dye染料的量使用定量酶標儀。
簡言之，將HaCaT細胞接種於其中96孔板（1×10 4個細胞/孔）並進行處理不同濃度（100％，10％，5％，3％，1％和0.2％）
米諾地爾和植物提取物。
72小時後培育期間，50μlXTT和活化劑試劑根據製造商的說明添加到每個板中說明。
然後，將細胞在37℃下孵育4小時為了使XTT試劑還原成甲compound化合物。
在BIO-RAD中讀取吸光度酶標儀，在450納米處減去背景測量620 nm。
HaCaT cells were incubated with 1% concentration of
both minoxidil solution and the botanical extract before total
RNA isolation. Total RNA was extracted by using
TRI-reagent according to manufacturer’s instructions
(Sigma Aldrich). The concentration and purity of isolated
RNA samples were determined by measuring optical densities at 260 nm and 280 nm using BioSpec- nano
2.5. RNA Isolation(RNA分離)
將HaCaT細胞與1％濃度的細胞一起溫育米諾地爾溶液和植物提取物總量之前
RNA分離。
通過使用提取總RNA
TRI試劑根據製造商的說明（西格瑪奧德里奇）。分離的濃度和純度通過使用BioSpec-nano測量260nm和280nm處的光密度來確定RNA樣品。
Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit was
used for reverse transcription. cDNA synthesis was
performed with 500 ng total RNA, 2 μM final concentration
of gene specific primers of VEGF, KGF, IL-1α, SRD5α type
2 and GAPDH (Integrated DNA Technologies), 10 U of
Transcriptor Reverse Transcriptase, 20 U of Protector RNase
Inhibitor, 1mM each of dNTP mix and Transcriptor Reverse
Transcription Buffer (5X) according to the manufacturer’s
instructions (Roche).
2.6. Reverse Transcription(逆轉錄聚合酶鏈式反應)
羅氏轉錄子第一鏈cDNA合成試劑盒是用於逆轉錄。
cDNA合成是用500ng總RNA，2μM終濃度進行VEGF，KGF，IL-1α，SRD5α型基因特異性引物的表達
2和GAPDH（綜合DNA技術），10U Transcriptor Reverse Transcriptase，20U Protector RNase抑製劑，
dNTP混合物和Transcriptor Reverse各1mM根據製造商的轉錄緩衝液（5X）說明（羅氏）。
Real-time PCR (RT-qPCR) reaction was carried out in
Light Cycler 96 (Roche) and Fast Start DNA Green Master
Kit (Roche) was used. Briefly, total volume of reaction mix
was 20 μl containing 10 μl SYBR Green Master Mix (2X),
0.5 μM of reverse and forward primers (Table 1), 2.5 ng
cDNA and appropriate amount of nuclease free water. All
samples were run as triplicates in each run including a
non-template control and four standards (1:10, 1:100 and
1:1000). The PCR parameters were determined separately
for each target according to melting and annealing
temperatures of primers. Each parameter includes a
pre-incubation step for 10 min at 95°C and followed by 45
cycles of 3-step amplification and melting step. Melting
curve analysis was performed to verify specificity. Three
repeats of gene expression analysis were done (n=3). For
quantitation of RT-qPCR results, ΔΔCt method was used
(2-ΔΔCt).
2.7. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction(實時定量聚合酶鍊式反應)
實時PCR（RT-qPCR）反應在Light Cycler 96（Roche）和Fast Start DNA Green Master
使用Kit（Roche）。
簡而言之，反應混合物的總體積是20μl含有10μlSYBRGreen Master Mix（2X），
0.5μM反向和正向引物（表1），2.5ng cDNA和適量的無核酸酶水。
所有樣品在每次運行中一式三份運行，包括a非模板控制和四個標準（1：10,1：100和1：1000）。
PCR參數分別確定根據熔化和退火對每個目標引物溫度。每個參數包括一個在95℃預溫育10分鐘，然後45℃3步擴增和熔化步驟的循環。
融化進行曲線分析以驗證特異性。三完成基因表達分析的重複（n = 3）。對於RT-qPCR結果的定量，使用ΔΔCt方法（2-ΔΔCT）。
All data are representative of three experiments and
expressed as mean ± standard error of the means (SEM).
Statistical evaluation was performed by Unpaired t-test using
Graph Pad Prism 5 Software (USA) and the results with p
value less than 0.05 were accepted as significant.
2.8. Statistical Analysis(統計分析)
所有數據都代表三個實驗和表示為平均值±平均值的標準誤差（SEM）。
使用非配對t檢驗進行統計學評價Graph Pad Prism 5軟件（美國）和p的結果
小於0.05的值被認為是顯著的。
3. Results
細胞毒性分析，米諾地爾精華和植物提取物顯示高濃度HaCaT細胞的細胞毒性作用。對於隨後的分析，可能的最高濃度確定為1％（圖1）。
*米諾地爾* *植物提取物*
**米諾地爾和植物提取物的細胞毒性分析結果提取物（虛線表示選擇用於孵育的濃度。）**
基因表達分析（Real time qPCR）
通過RT-qPCR進行基因表達分析的結果顯示植物提取物和米諾地爾都引起了
統計學顯著下調IL-1α基因表達與未處理的對照細胞相比。
該植物提取物導致IL-1α的0.19倍變化基因表達水平，而米諾地爾治療得到在0.34倍變化(如下圖)
(圖2)
植物提取物處理不顯著影響SRD5α2型基因表達。
VEGF是兩種治療均下調：其表達為減少到未處理的對照細胞的七分之一植物提取物，
而米諾地爾減少到四分之一對照組（圖2）。
米諾地爾和植物提取物處理使KGF基因表達降低至a控制的六分之一。
在最近的一項研究中顯示，每天兩次米諾地爾噴霧有效促進頭髮密度男性的額顳葉和頂點區域
另一方面，我們的臨床研究表明同時使用植物提取物精華液和用植物提取物配製的洗髮露
能夠減少患有TE和AGA的受試者
因此，在這項研究中，米諾地爾被比較我們的細胞水平的植物提取物。
根據我們的細胞培養研究結果顯示，米諾地爾受到抑制SRD5α2，VEGF和KGF的表達與植物
以類似的方式提取抑制的VEGF和KGF然而，米諾地爾（表2）沒有顯示出顯著性對SRD5α2表達的影響
可以有各種各樣的米諾地爾和我們的植物提取物的機制執行減少脫髮的動作。
米諾地爾抑制5α-還原酶II可能是其中一種機制，但不是我們的植物提取物（圖2）。
其中我們測試的因素，IL-1α是唯一的受米諾地爾和植物提取物的影響同樣的方式，
也是預期的方式兩者都下調了。植物提取物減少IL-1α基因表達相當於對照的五分之一
減少至米諾地爾對照的三分之一治療（圖2）。
由於IL-1α顯示出抑製作用人類毛囊生長和頭髮纖維的生產全器官培養，這種因素的下調可能
解釋我們的植物提取物和米諾地爾對其的影響脫髮。
4.結論
這是我們的假設由不同植物組成植物提取物可有效對抗脫髮。
但是，他們的必須通過安慰劑對照評估有效性臨床研究以及進一步的細胞研究。
(詳細研究請看 https://goo.gl/zWTn3C )
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